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Gina Castro S.; Mercy Ramírez V.; Hermelinda Rivera G., Alberto Manchego S.; Dennis Navarro M.; Ana Castillo E. - Sección de Virología del Lab. de Microbiología y Parasitología de la Fac. de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMV-UNMSM)
23/11/2017 | Comentarios(0).




Análisis filogenético de cepas emergentes del virus de la diarrea epidémica porcina en Perú

El PED afecta principalmente a lechones lactantes, generalmente de 1 a 3 semanas de edad, ocasionando severos cuadros de diarrea, vómitos, deshidratación y alta mortalidad.

NOVIEMBRE 23/2017 | Comentarios(0).

Resumen

La Diarrea Epidémica Porcina (PED) emergió en setiembre del 2013, afectando granjas porcinas en el Perú. El virus fue diagnosticado mediante RT-PCR en tiempo real. Para conocer el origen y variabilidad de las cepas del virus la diarrea epidémica porcina (PEDV) se realizó el análisis filogenético del dominio S1 de siete cepas virales detectadas en Perú.

Las secuencias fueron alineadas y analizadas utilizando cepas referenciales disponibles en GeneBank. El análisis filogenético se realizó con el método de Neighborjoining, software MEGA 6.5.

Las cepas analizadas se ubicaron en el clado de cepas norteamericanas genogrupo 1 (n=1) y genogrupo 2 (n=6). Las seis cepas del genogrupo 2 (G2) tuvieron 99.7–100.0% de identidad entre ellas y de 99.3-100.0% con cepas norteamericanas descritas desde 2013. La cepa del genogrupo 1 (G1) presentó 99.6-99.7% de identidad con cepas G1 norteamericanas. Ambos grupos evidenciaron mayor distancia genética con cepas asiáticas. Las cepas analizadas presentan mutaciones puntuales evidenciando nuevas variantes en el Perú.

Introducción

La Diarrea Epidémica Porcina (PED, siglas en inglés) es una enfermedad entérica altamente contagiosa que está causando grandes pérdidas económicas en la industria porcina a nivel mundial. Afecta principalmente a lechones lactantes, generalmente de 1 a 3 semanas de edad, ocasionando severos cuadros de diarrea, vómitos, deshidratación y alta mortalidad que puede alcanzar hasta el 100% de los lechones (Song y Park, 2012). 

Fue considerada una enfermedad exótica en el Perú hasta su confirmación mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real en Setiembre del 2013, fecha en la cual la Sección de Virología del Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) reportó su presencia en coordinación con el Servicio Nacional de Sanidad Agraria –SENASA (SENASA, 2013).

El agente causal, el virus de Diarrea Epidémica Porcina (PEDV, siglas en inglés), es un virus ARN de cadena simple y polaridad positiva, perteneciente al género Alfacoronavirus perteneciente a la subfamilia Coronavirinae, familia Coronaviridae. 

Posee un genoma de 28Kb aproximadamente conformado por 7 marcos de lecturas abiertas (ORFs, siglas en inglés) que codifican 4 proteínas estructurales: Espícula (Spike, S), envoltura (E), Membrana (M) y la nucleocapside (N), además de tres proteínas no estructurales (replicasa 1a y 1b) y el ORF3 (Song y Park, 2012).

El gen que codifica a la proteína S es el mayor gen estructural, responsable de la unión al receptor celular e inductor de la formación de anticuerpos neutralizantes y de la fusión celular, por lo que es utilizado como blanco para determinar la variabilidad genética del virus (Jung y Saif, 2015). 

Diversos estudios revelan que el análisis parcial del gen S, el dominio S1 y el dominio N-terminal S1 constituyen una herramienta muy útil para realizar el estudio de diversidad genética, ya que contienen los mayores sitios de variación y región del epítope, guardando gran concordancia con el análisis del genoma completo (Lee et al., 2010; Lv et al., 2016).

El análisis genético y filogenético del dominio S1 del gen S de las cepas del PEDV aisladas en el Perú es importante para determinar la procedencia del virus existente en el país, así como conocer la diversidad genética de las cepas para entender mejor la evolución natural del virus bajo las condiciones de crianza y manejo en el Perú; información importante para la implementación de programas de prevención, control y erradicación de esta enfermedad (Jarvis et al., 2016).

Materiales y Métodos

Se utilizaron muestras de lechones de 1 a 3 semanas de edad provenientes de granjas afectadas, donde se observaron cuadros severos de diarrea en lechones con alta morbilidad y mortalidad, durante el año 2013-2014. Dichas muestras correspondieron a porciones de intestino delgado, a partir de los cuales se colectó y procesó el contenido intestinal. 

Las muestras fueron analizadas mediante inmunocromatografía (Anigen Rapid TGE/PED Ag Test, Bionote Korea) y posteriormente confirmadas por RT-PCR en tiempo real mediante el protocolo dúplex estandarizado en el laboratorio que detecta a PEDV y al virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV, siglas en inglés). Se seleccionaron muestras positivas que evidenciaron alta carga viral en la prueba molecular.

Posteriormente se utilizaron cebadores específicos para la amplificación del dominio S1, descritos por el Laboratorio de Investigación de Enfermedad Animal y Diagnóstico VBSD-ADRDL de la Universidad de Dakota del Sur (South Dakota State University). Los productos fueron secuenciados mediante el método de sanger automatizado. Se obtuvieron secuencias nucleotídicas completas del dominio S1 de 7 cepas peruanas, las cuales fueron alineadas y analizadas utilizando secuencias de cepas referenciales globales (americanas y asiáticas) disponibles en GeneBank. 

El análisis filogenético se basó en el método de Neighbor-joining (NJ) utilizando el modelo de distancia Kimura 2 parámetros y análisis bootstrap de 1000 réplicas para la determinación del valor de fiabilidad porcentual en cada nodo interno del árbol (Chen et al., 2013), y utilizando el software MEGA 6.5.

Resultados

En el análisis filogenético basado en el dominio S1, se observó que las 7 cepas peruanas fueron ubicadas en el genogrupo 1 (G1) (n=6) y genogrupo 2 (G2) o S-INDEL (cepas que presentan inserciones y deleciones nucleotídicas en el gen S) (n=1) (Figura 1). 

El dendograma evidencia que las 6 cepas peruanas correspondientes al genogrupo 1 presentaron valores de identidad de 99.7– 100.0% entre ellas y de 99.3-100.0% con cepas norteamericanas descritas desde el año 2013. A su vez, la cepa correspondiente al genogrupo 2 presenta valores de identidad de 99.6-99.7% con cepas S-INDEL norteamericanas. 

Ambos grupos presentaron mayor distancia genética con cepas asiáticas, donde las cepas G2 peruanas (n=6) presentan valores de identidad de 98.5-99.2% con respecto a las cepas G2 asiáticas; y la cepa G1 peruana presenta 94.7-96.7% de identidad con respecto a las cepas G1 asiáticas. Así mismo, se observaron mutaciones puntuales entre las cepas peruanas del genogrupo 2.

Discusión

El análisis filogenético de las cepas del PEDV peruanas es una herramienta importante para conocer la diversidad genética de las cepas circulantes y entender mejor la evolución natural del virus emergente, permitiendo determinar la procedencia del virus, así como el estatus epidemiológico en campo y los cambios moleculares propios del agente en adaptación a las condiciones de crianza existentes en el país (Jarvis et al., 2016).

Al realizar el análisis filogenético, basado en el análisis del dominio S1 de cepas peruanas del PEDV en relación a diversas cepas globales y referenciadas en GeneBank, se pudo observar la estrecha relación entre las cepas peruanas y las cepas Norteamericanas (valores de identidad del 99.3-100%), confirmando el origen estadounidense de las cepas peruanas, en vista a la ruta de diseminación observada tras la emergencia en los Estados Unidos, que afectó a Canadá y México poco tiempo después, y posteriormente a Sudamérica, donde el virus ingresó a Perú pocos meses después (SENASA, 2013). 

El ingreso del virus al Perú se atribuye a la estrecha relación comercial de porcinos vivos existente con los Estados Unidos.

El presente trabajo evidencia la presencia simultánea de cepas correspondientes al genogrupo 1 (n=1) y genogrupo 2 (n=6) a partir del brote en el año 2013. Así mismo, los resultados reflejan la variación existente en las cepas de nuestro medio (99.7–100.0%). Se pudieron observar mutaciones puntuales a lo largo de la secuencia S1 analizada en las diferentes cepas peruanas de genogrupo 2, evidenciando la presencia de variantes propias del Perú.

Conclusiones

Las cepas peruanas del virus de la diarrea epidémica porcina detectadas en el 2013-2014 son de origen norteamericano. Así mismo, se evidencia la presencia de los genogrupos 1 (o S-INDEL) y 2, basado en el análisis de secuencia del dominio S1 de PEDV. Se evidencia la presencia de cepas variantes propias del país.

Agradecimientos

Los autores manifiestan su agradecimiento al Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos – UNMSM, ente financiador del presente estudio (Código Proyecto N° 150801101).

Referencias

- 1. Chen J, Liu X, Shi D, Shi H, Zhang X, Li C, Chi Y, Feng L. 2013. Detection and Molecular Diversity of Spike Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in China. Viruses 5, 2601-2613. doi:10.3390/v5102601

- 2. Jarvis MC, Lam HC, Zhang Y, Wang L, Hesse RA, Hause BM, Vlasova A, Wang Q, Zhang J, Nelson MI, Murtaugh MP, Marthaler D. 2016. Genomic and evolutionary inferences between American and global strains of porcine epidemic diarrhea virus. Preventive Veterinary Medicine 123, 175- 184. doi: 10.1016/j. prevetmed.2015.10.020

- 3. Jung K, Saif LJ. 2015. Porcine epidemic diarrhea virus infection: Etiology, epidemiology, pathogenesis and immunoprophylaxis. The Veterinary Journal 204 (2): 134-143. doi: 10.1016/j.tvjl.2015.02.017

- 4. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. 2010. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea. Virus Research 149, 175–182. doi: 10.1016/j. virusres.2010.01.015

- 5. Lv C, Xiao Y, Li XD, Tian K. 2016. Porcine epidemic diarrhea virus: current insights. Virus Adaptation and Treatment 8, 1-17. doi: 10.2147/VAAT.S107275

- 6. [SENASA] Servicio Nacional de Sanidad Agraria. 2013. Dirección de Sanidad Animal. Ministerio de Agricultura y Riego. República del Perú. Boletín Epidemiológico. Semana Epidemiológica N°40-44. [Internet] [Octubre de 2013]. Disponible en: http://www.senasa.gob.pe/0/modulos/JER/JER_Interna.aspx?ARE=0&PFL=1&JER=190

- 7. Song D, Park B. 2012. Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines. Virus Genes 44:167-175. doi: 10.1007/s11262-012-0713-1


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