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Doctor Luis Ramos G., Dr. Carlos Camacho, Dr. Lenin Maturrano, Dra Rosa Perales, Dr. Luis Luna E. -
Perú 04/10/2012 | Comentarios(0).




Mecanismo de virulencia que usa el Mycoplasma hyopneumoniae para adherirse a los cilios del tracto respiratorio mediante el gen P97



OCTUBRE 04/2012 | Comentarios(0).

La importancia de conocer el mecanismo de virulencia que usa el Mycoplasma hyopneumoniae para adherirse a los cilios del tracto respiratorio medio y bajo, es poco conocido, pero todo nos conduce al gen designado como P97 aislado de cepas de USA y México (Zhang etal., 1995), observándose que su actividad se localiza en las regiones de repetición R1 y R2 que forman el sitio de enlace; siendo claro que la P97 por si sola es totalmente competente para la adhesión (Minion et al., 2000). En Perú se han realizado diversos estudios sobre este agente, principalmente realizando diagnósticos serológicos y ensayos vacúnales tanto en madres como en lechones. Pero desconocíamos el mecanismo de patogénesis que usa el Mycoplasma, por esta razón desarrollamos el presente estudio. Dado que se han descrito pruebas moleculares altamente sensibles que permiten la detección del microorganismo en animales vivos, a fin de entender epidemiológicamente la circulación y la transmisión de este microorganismo en las granjas (Kobisch y Frey, 2001).

MATERIALES Y MÉTODOS

Se tomaron muestras de pulmones de 30 animales, con lesiones macroscópicas compatibles con neumonía enzoótica, de un camal ubicado al oeste de Lima, procedentes de granjas tecnificadas, cuya edad promedio era 5 meses.

RESULTADOS

Lesiones Macroscópicas

Se tomaron 6 cm3 de las muestras de lóbulos pulmonares craneales (apicales) y/o medio (cardiacos) derechos con lesiones sospechosas de la enfermedad, encontrándose lesiones sospechosas de NEP grado 3 basándose en la escala subjetiva propuesta por Piffer & Brito. (1991).

En todas las muestras se seleccionó áreas de consolidación moradas a grisáceas, siempre en los lóbulos apicales y cardiacos derechos, pudiendo variar en grados y extensión, tomando lóbulos cercanos como el intermedio y la porción anterior del lóbulo diafragmático de los pulmones, evitando lesiones granulomatosas, pericarditis, pleuritis, etc, que pudieran evidenciar infecciones con agentes secundarios, Camacho et al (2003).

En los casos que se realizó la incisión al área afectada, la consistencia era carnosa pero no firme, exudando abundante líquido sanguinolento. Los nódulos linfáticos mediastínicos se encontraban en su mayoría aumentados de tamaño y congestionados, según se observa en la figura 1.

 

 

Prueba molecular PCR

Del total de las muestras (n=30), la prueba de PCR detectó 14 muestras positivas que representan el 46.7% (14/30), se observó 16 muestras negativas a la prueba 53.3% (16/30) del total analizado. Además del total de granjas evaluadas (n=16), el 62.5% (10/16) presentó animales positivos a PCR.

 

 

Histopatología

De las 30 muestras de tejido pulmonar, 18 tuvieron hiperplasia de BALT de grado 3 y 4, grados indicativos de neumonía enzoótica porcina. Resultados de la prueba de PCR: MW (Marcador de Probabilidad = 0.196 (No significativo α > 0.05 por lo tanto no hay asociación estadística).

Al presentar un valor menor a 5 en algún cuadrante, se propuso la prueba Fisher exacto donde tampoco se demostraba asociación; al igual que algunas pruebas como Kappa y Mc Nemar.

 

 

DISCUSIÓN

La detección de ácidos nucléicos de M. hyopneumoniae se realiza mayormente en individuos con sintomatología clínica, positiva a ELISA e historial de no vacunación contra Mycoplasma hyopneumoniae (Yamaguti et al., 2008). Debido a la poca posibilidad de hallar el patógeno en muestras de animales aparentemente sanos. La prueba molecular de PCR, incrementa el diagnóstico en porcinos infectado con M. hyopneumoniae, debido a que animales sospechosos de NEP resultaron positivos (47%) similar a lo reportado por otros autores (Kurth et al., 2002; Cai et al., 2007).

La presencia de M. hyopneumoniae del 47% de porcinos procedentes de granjas de crianza intensiva de la costa del Perú es descrita por Calle et al 2008 reportó un 35% de seroreactores positivos en edad de beneficio mediante la técnica de ELISA, a diferencia de que en este trabajo se encontró un 62.5% de granjas infectadas.

Esto puede deberse a que las pruebas serológicas detectan anticuerpos que puede resultar falsos positivos al reaccionar con otros mycoplasmas como M. floculare y M. hyorhinis (Strasser et al., 1992), debido a que tienen proteínas comunes p74, p53 kDa (Mori et al., 1998; Guzmán et al. 2008) o las proteínas p73 y p41 kDa (Boelske et al., 1987).

Estudios realizados en México, Estados Unidos y Francia, revelan el carácter enzoótico de la enfermedad (Kobisch, 2001). Observándose prevalencias entre el 30-80% de Mycoplasma hyopneumoniae. Los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran un 46.6% (14/30)de cerdos positivos a PCR, frente al 66.7% (20/30) de seroreactores positivos en una granja sin antecedentes de vacunación encontrados por Torres (2003).

El análisis de asociación de los datos no reveló significancia entre el hallazgo patológico (muestras no diagnósticas, con puntuación de 0 a 2 y diagnósticas con puntuación de 3 a 4, de acuerdo a lo descrito por Livingston et al., 1972) y la detección mediante PCR. A diferencia de los resultados de Guzmán et al. (2008), que si demuestran una correlación debido al alto número de casos positivos a PCR anidado, con un alto porcentaje de lesiones pulmonares sugerentes de NEP.

 

 

Esto puede ser debido a que ambas técnicas miden diferentes aspectos de la Micoplasmosis, la técnica de PCR detecta la presencia de genoma bacteriano y el examen histopatológico identifica lesiones microscópicas en el pulmón, no se esperaba un acuerdo completo entre ambas técnicas (Calsamiglia et al., 2000; Cai et al., 2007; Moorkamp et al., 2007). Esto se explica por la escasa cantidad de microorganismos presentes en tejido pulmonar, eliminación por acción de la inmunidad de base humoral y celular (Blanchard et al., 1992; Sibila et al., 2009) y al reducido número de muestras de animales que se usaron para determinar la presencia de Mycoplasma hyopneumoniae por PCR.

Es importante tomar en cuenta que la vacunación también reduce el número de microorganismo activando el sistema inmune tanto humoral como celular, así la IgG participa en la opsonización y fagocitosis por macrófagos alveolares, en ratones (Chen et al., 2003).

Los hallazgos histopatológicos relacionados con NEP, son motivo de controversia. En este estudio, las muestras con hiperplasia del BALT grados 1 y 2 positivas a Mycoplasma hyopneumoniae mediante PCR, no presentaron cambios morfológicos que permitieran inferir el diagnóstico de NEP mediante histopatología, debido a infecciones tempranas o tardías, donde el microorganismo está presente, pero no hay lesiones típicas existentes, infecciones simultaneas pueden haber enmascarado las lesiones características del M. hyopneumoniae o la sección de pulmón obtenidos para el examen histopatológico fue insuficiente o no representativa (Calsamiglia et al., 2000, Verdin et al, 2000).

 

 

La neumonía broncointersticial (Gourlay y Howard, 1982; Strasser et al., 1992; Dungworth, 1993; Maes et al., 1996) es característica de varias Mycoplasmosis respiratorias. Las lesiones predominantes en este estudio son: Bronconeumonía intersticial serosa no supurativa difusa aguda, de los que se obtuvo el mayor porcentaje de positivos a PCR, coincidiendo con los resultados obtenidos por Guzmán et al., (2008). Seguida de Bronconeumonía serosa no supurativa difusa aguda con un 6.6% (2/30) de positivos a PCR, además de una Bronconeumonía mucocatarral no supurativa focal aguda con un 10% (3/30) de positivos a PCR. Aunque la severidad de las lesiones producidas pudo ser influenciada por el grado de colonización o virulencia (o ambas) de la cepa de Mycoplasma hyopneumoniae usada (Howard etal., 1987).

Los hallazgos microscópicos y PCR evidencian la posibilidad de que el desarrollo de las lesiones lleve un ritmo diferente considerando factores como virulencia de las cepas, origen de los cerdos (diferentes granjas), condiciones de manejo (todo dentro todo fuera), densidades poblacionales, rangos de temperatura, calidad de la ventilación, tipo de explotación, edad al destete, edad de las madres, entre otros; así como la situación epidemiológica de las granjas frente al M. hyopneumoniae (incidencia, densidad de carga bacteriana, inmunidad activa y pasiva), y asociación con otros agentes virales y bacterianos.

 

 

La distribución de M. hyopneumoniae, según los resultados obtenidos por la técnica de PCR pertenecientes a granjas de la Costa Central con mayor cantidad de positivos a PCR; seguido por los departamentos de la Costa Norte, Lambayeque con el total de muestras positivas y La Libertad con la mitad de muestras positivas. Cabe resaltar que la NEP no está considerada dentro de las enfermedades notificable por el SENASA, la distribución de esta enfermedad no están registrados.



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